Первое применение у человека внеклеточных везикул из пуповины человека при операции по устранению фиксации спинного мозга. Краткое изложение

Основные положения и результаты:

Статья описывает клинический случай одного ребенка. Двухлетней девочке со spina bifida в Германии провели операцию по устранению фиксации спинного мозга, и во время операции хирурги нанесли внеклеточные везикулы (ВВ), полученные из мезенхимальных стромальных клеток пуповины, непосредственно на ее спинной мозг. ВВ не являются клетками. Это крошечные окруженные мембраной частицы, которые выделяют клетки. Считается, что они переносят значительную часть противовоспалительных и противорубцовых сигналов, которые производят мезенхимальные стромальные клетки.

Препарат удалось нанести, и за шесть месяцев не возникло ни одного нежелательного явления. Пользы показано не было, функция ног у девочки не изменилась. Как неоднократно подчеркивают авторы, единичный случай без сравнения не может установить большего. Мы включили этот отчет, потому что в нем описано первое применение у человека продукта из клеток пуповины, введенного интратекально ребенку со spina bifida. Кроме того, он касается фиксации и рубцевания спинного мозга после первичной коррекции, проблемы, с которой многие семьи сталкиваются позже.

Цель:

Проверить, технически ли осуществимо нанесение ВВ, полученных из МСК пуповины (UC-MSC-EV), на спинной мозг во время операции по устранению фиксации спинного мозга, с более отдаленной надеждой уменьшить рубцевание внутри твердой мозговой оболочки и дальнейшее повреждение нервов.

Методы:

Открытый дефект нервной трубки у девочки был диагностирован до рождения. Его закрыли микрохирургически в день ее рождения путем кесарева сечения в Университетской клинике Лейпцига, а в возрасте 6 недель ей потребовался вентрикулоперитонеальный шунт. Плановая МРТ в один год выявила три проблемы в месте коррекции: растущую дермоидную инклюзионную опухоль внутри спинного мозга, фиксацию спинного мозга и полость с жидкостью (сирингомиелию), распространявшуюся через поясничный и грудной отделы спинного мозга. Двигательная функция у нее не ухудшилась и оставалась на функциональном уровне L3. Команда оценила риск будущего ухудшения как высокий и рекомендовала операцию.

Лечение проводилось вне клинического исследования как «индивидуальная попытка лечения» (применение у одного указанного пациента). Его рассмотрел внутренний наблюдательный совет Университетской клиники Зальцбурга, а родители дали письменное согласие на экспериментальное интратекальное применение.

Препарат: ВВ были произведены по правилам надлежащей производственной практики (GMP) в Медицинском университете Парацельса в Зальцбурге (Австрия), у которого есть лицензия на производство MSC-EV для исследований фаз 1–3.

• Источник: МСК пуповины от одного донора, хранящиеся в виде главного и рабочего банков клеток и проверенные по стандартам Европейской фармакопеи.
• Клетки выращивали с 5% объединенного лизата тромбоцитов человека, без веществ животного происхождения. На момент сбора они были на 8-м пассаже, что соответствует примерно 17 удвоениям популяции.
• ВВ собирали из бессывороточной среды через 24 часа, концентрировали тангенциальной поточной фильтрацией через фильтр 100 кДа, стерильно фильтровали через 0,22 микрометра и хранили при -80°C во флаконах по 2 мл.
• Использованная партия содержала 6,5 × 10¹⁰ частиц на мл со средним диаметром 130,7 нм и 0,768 мг белка на мл. Она несла ожидаемые маркеры ВВ (CD9, CD63, CD81) и маркеры МСК (CD29, CD44, CD49e, CD73) и была отрицательной по HLA-ABC и HLA-DR. Цитокины IL-1 бета, IL-6, IL-8, IL-10 и TNF-альфа не обнаружены. Эндотоксин составлял 0,83 МЕ/мл. Биологическая активность подтверждена ферментным тестом на CD73.

Операция: Операцию проводили в положении лежа на животе при непрерывном нейрофизиологическом мониторинге. Хирурги обнаружили выраженную фиксацию дермоидной тканью внутри нервной трубки и прилегающей липомой, сращенной с дуральным мешком, и удалили и то, и другое. Затем ВВ наносили в следующей последовательности:

• 1,0 мл жидкости с ВВ нанесли на открытую нервную пластинку и ввели в полость сиринкса
• нервную пластинку закрыли швами 8-0
• 0,5 мл нанесли на ушитую нервную пластинку
• 0,5 мл поместили в дуральный мешок при его герметичном закрытии

Общий интратекальный объем составил 2,0 мл, что по нашему расчету на основе указанной концентрации соответствует примерно 1,3 × 10¹¹ частиц.

Результаты:

• Мониторинг не показал ухудшения во время операции. Двигательные ответы присутствовали во всех сегментах, включая сфинктер, а прямая стимуляция показала работающие двигательные корешки вплоть до S2.
• Послеоперационный период протекал без осложнений, и через 7 дней девочку выписали домой.
• МРТ на 5-й день показала хорошее освобождение спинного мозга, отсутствие отека спинного мозга и уменьшение сиринкса.
• За шесть месяцев наблюдения нежелательных явлений не было.
• Двигательная функция не изменилась и оставалась на уровне L3. При нейропедиатрическом осмотре через шесть месяцев отмечено небольшое улучшение чувствительности и терморегуляции в обеих ногах.

В аннотации сказано, что неврологический дефицит «остался неизменным». Описание случая в основном тексте добавляет небольшое улучшение чувствительности. Оба сходятся в том, что движения не улучшились.

Выводы:

Авторы заключают, что прямое нанесение UC-MSC-EV во время операции при spina bifida осуществимо и его следует проверить на животных моделях и в исследованиях фазы I/II. Приносит ли это какую-либо стойкую неврологическую пользу, «необходимо тщательно изучить в рандомизированных контролируемых исследованиях».

Авторы перечисляют несколько ограничений:

• Не было ни контроля, ни рандомизации. Хороший результат МРТ и стабильная функция могут быть следствием одной лишь успешной операции по устранению фиксации. Авторы пишут, что сделать какой-либо окончательный вывод о пользе невозможно.
• Подходящая доза неизвестна. Количество было выбрано на основе более ранних экспериментальных работ и введено однократно. Неизвестно, было бы большее количество или повторное введение другим путем лучше или рискованнее.
• Шести месяцев наблюдения недостаточно. Рубцевание и повторная фиксация развиваются годами, и отсроченные нежелательные эффекты исключить нельзя.
• Ответ может различаться. Донор, номер пассажа и метод выделения со стороны производства, а также иммунный статус со стороны пациента могут влиять на эффект. У этого ребенка иммунной реакции не наблюдалось, но теоретический риск сохраняется.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Дополнительная информация:

Фиксация спинного мозга: После коррекции spina bifida рубцовая ткань может прикрепить спинной мозг к твердой мозговой оболочке. По мере роста ребенка спинной мозг растягивается, и функция может быть утрачена. В статье приводятся данные наблюдения исследования MOMS, согласно которым симптомный синдром фиксированного спинного мозга, требующий операции, развивался у 27% детей, прооперированных до рождения, и у 15% прооперированных после рождения, а инклюзионные кисты в нервной пластинке также чаще встречались после пренатальной коррекции (11% против 3%). В датской серии 45 из 166 пациентов потребовалось устранение фиксации, чаще всего из-за прогрессирующей деформации позвоночника (40%), ухудшения ходьбы (38%) или ухудшения функции мочевого пузыря или кишечника (32%). Сама операция по устранению фиксации несет риск повторной фиксации из-за нового рубцевания около 15%. В настоящее время, кроме тщательной хирургической техники, нет лечения, которое предотвращало бы это рубцевание.

Обоснование применения ВВ: Лабораторные исследования и исследования на животных, на которые ссылаются авторы, показывают, что ВВ из МСК подавляют воспаление и рубцевание после травмы спинного мозга и действуют на микроглию, иммунные клетки нервной системы. UC-MSC-EV той же группы уже однажды применялись у человека, во внутреннем ухе во время операции по кохлеарной имплантации, с удовлетворительным профилем безопасности.