Иммуномодулирующие мезенхимальные стромальные клетки амниона сохраняют функцию мышц на мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна

Основные выводы и результаты:

Это исследование на животных. Пациентов не лечили. Японская команда из Токийского университета, Медицинской школы Ниппон и компании Kaneka Corporation вводила мезенхимальные стромальные клетки амниона человека (чМСКА) мышам mdx, стандартной мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна, повторными инъекциями в хвостовую вену и наблюдала за мышами до года.

Для семьи, обдумывающей лечение, статья показывает следующее: в лаборатории эти клетки успокаивают иммунную систему, смещая макрофаги в сторону противовоспалительного типа M2; повторные внутривенные дозы мыши переносили, и они уменьшали воспаление мышц; леченые мыши сохраняли большую силу хвата, пробегали большую дистанцию и через год имели чуть лучшую функцию сердца. Статья не показывает, что что-либо из этого происходит у детей. Клетки были получены из амниона, а не из пуповины, как в нашей собственной программе, и они не восстанавливали дистрофин, недостающий белок, вызывающий болезнь. Клетки предоставила компания Kaneka Corporation, которая частично финансировала работу и в которой работают четверо из авторов.

Цель:

Проверить, смещают ли чМСКА макрофаги человека в сторону типа M2 и улучшает ли повторное системное введение чМСКА на ранней стадии болезни функцию скелетных мышц и сердца у мышей mdx.

Методы:

Клетки. Амнион брали с согласия из плодных оболочек женщин, рожавших путем кесарева сечения. Клетки выделяли ферментативным расщеплением, наращивали, замораживали и использовали между пассажами 1 и 5. Они несли обычные маркеры МСК (CD73, CD90, CD105), не имели CD45, CD34, CD14, CD11b, CD19 и HLA-DR и образовывали в культуре кость и хрящ, но не жир.

Лабораторная работа. Мононуклеарные клетки крови человека культивировали совместно с чМСКА в соотношении 20 к 1, а маркеры макрофагов измеряли проточной цитометрией и методом кПЦР, используя индометацин для блокирования простагландина E2 (PGE2).

Животные. Самцов мышей mdx на фоне C57BL/10 случайным образом разделили на контрольную и леченую группы. Каждая доза составляла 8,0 × 10⁵ чМСКА в 100 мкл физиологического раствора в хвостовую вену раз в неделю, начиная с возраста от 4 до 5 недель. Краткосрочная ветвь получила четыре дозы (n = 10, оценка в возрасте 12 и 18 недель, против 14 контрольных мышей mdx и 7 мышей дикого типа). Долгосрочная ветвь получила четыре дозы (n = 6) или шесть доз (n = 4), и ее оценивали через один год против 12 контрольных мышей mdx и 7 мышей дикого типа. Многие показатели измеряли в подгруппах от 3 до 8 мышей, они указаны ниже. Заранее заданным первичным показателем была долгосрочная двигательная функция (сила хвата передними лапами и скорость бега), гистология была вторичной. Исследователи не могли быть слепыми в отношении линии мышей; бег регистрировали автоматическим колесом в течение пяти дней. Данные исключали, если мышь потеряла вес, была травмирована или ослаблена или если значение считали странным.

Результаты:

Иммунные эффекты в чашке. чМСКА снижали пролиферацию активированных Т-клеток с 90,1% до 59,9% (p ниже 0,0001) и секретировали PGE2. Доля CD206-положительных (M2) клеток умеренно выросла, с 11,3% до 14,2% (p = 0,035), тогда как клетки M1 не изменились. Индометацин устранил рост CD206, что указывает на PGE2 как на посредника.

Переносимость. Масса тела леченых и нелеченых мышей mdx не различалась ни в один момент. Других показателей безопасности (исследование органов, скрининг опухолей, иммунная реакция на клетки человека) не приводится.

Краткосрочно (возраст от 12 до 18 недель, четыре дозы):

• Креатинкиназа в сыворотке, маркер утечки из мышц, была ниже через четыре недели после последней дозы (435 ± 79 против 583 ± 92 нг/мл, p = 0,038, n = 6 против 4), но не через десять недель (582 против 700 нг/мл, p = 0,228). Авторы называют это преходящим.
• IL-6 в передней большеберцовой мышце: 10,0 ± 3,8 против 94,2 ± 64,1 пг/мл (p = 0,002, n = 4 против 5).
• Сила хвата в 12 недель: 336,8 ± 21,0 г против 280,0 ± 37,8 г (p = 0,0008; в пересчете на массу тела 10,3 против 8,8 г/г, p = 0,012; n = 10 против 14).
• Площадь макрофагов (F4/80) в диафрагме: 14,0% против 19,5% (p = 0,013, n = 4 против 3). Доля макрофагов с маркером M2 CD206 в передней большеберцовой мышце выросла с 17,6% до 55,5% (p ниже 0,0001).
• Клетки человека нашли в передней большеберцовой мышце через четыре недели после лечения, они занимали лишь 0,0036% площади среза, а к десятой неделе исчезли. Дистрофин не обнаружен, поэтому клетки не исправляли основной дефект.

Долгосрочно (один год, четыре или шесть доз, обычно объединенные группы):

• Инфильтрация мононуклеарными клетками в передней большеберцовой мышце: 9,0% в контроле, 7,3% после четырех доз, 4,7% после шести; значимости достигла только группа с шестью дозами (p = 0,038, n = 4 в каждой леченой группе против 14). В диафрагме различий не было.
• Волокна с центральными ядрами, признак повторяющейся дегенерации и регенерации: 64,3% против 82,0% (p = 0,014, n = 5 против 7).
• Фиброз не уменьшился ни в передней большеберцовой мышце, ни в диафрагме, ни в сердце.
• Сила хвата: 296,5 ± 27,2 г против 265,7 ± 26,3 г (p = 0,049; в пересчете 8,6 против 7,3 г/г, p = 0,002; n = 8 против 12). Мыши дикого типа показали 336,4 г, то есть леченые мыши оказались между двумя группами.
• Максимальная скорость бега не различалась (21,6 против 20,5 м/мин, p = 0,77). Ежедневная дистанция бега была больше (3 649 ± 1 025 против 2 420 ± 788 м/сут, p = 0,028, n = 8 против 10), как и средняя дистанция в минуту (18,3 против 14,7 м/мин, p = 0,047, n = 5 против 5).
• Сердце: различий в общей морфологии, фиброзе и поляризации макрофагов не было, но инфильтрация мононуклеарными клетками была меньше (n = 6 против 6), а фракция укорочения левого желудочка выше: 37,0 ± 2,3% против 33,6% (p = 0,017; дикий тип 39,6%). В заголовке таблицы 2 указано 8 леченых мышей, а в ее сноске и в подписи к рисунку указано 5, это противоречие в самой статье.

Выводы:

Авторы заключают, что раннее повторное системное лечение чМСКА задерживало воспаление и снижение двигательной функции у мышей mdx, вероятно за счет поляризации макрофагов в тип M2, а не за счет превращения клеток в мышцу. Они предполагают, что его можно сочетать со стероидами или с генной терапией.

Ограничения, которые указывают авторы:

• Заболевание сердца у мышей mdx легкое по сравнению с пациентами, поэтому данные по сердцу дают ограниченную информацию о людях. Они предлагают подтвердить это на собачьей модели.
• Клетки человека сохранялись лишь недолго, и то, как секретируемые факторы дают долговременные эффекты, не установлено; механизм еще предстоит выяснить.
• Длительное культивирование и наращивание МСК несут риски старения и хромосомных изменений, а иммуносупрессивная способность зависит от источника ткани.
• Из методов: исследователи не были слепыми в отношении линии, часть данных исключили по суждению, а долгосрочные группы были малы.

Справочная информация:

Мышечной дистрофией Дюшенна страдает примерно 1 из 3 500 новорожденных мальчиков. Стероиды являются стандартным противовоспалительным лечением, но ответ на них различается, а побочные эффекты часты. Та же команда ранее сообщила, что повторное внутривенное введение стволовых клеток пульпы зуба сохраняло двигательную активность у мышей mdx и дистрофичных собак. Авторы отмечают, что внутривенно введенные МСК в основном застревают в легких и погибают там, а их иммунный эффект, по-видимому, возникает из-за того, как собственные фагоциты реципиента реагируют на погибающие клетки. В статье нет данных о клетках из пуповины и не упоминается ни одно исследование клеток амниона при болезни Дюшенна у людей.