Терапия in vivo при пренатальной коррекции миеломенингоцеле на модели плода овцы с помощью мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека: подтверждение принципа. Краткое изложение

Основные положения и результаты:

Это исследование на нерожденных ягнятах. Людей не лечили. Команда Университетского медицинского центра Гамбург-Эппендорф (Германия) создавала у плодов ягнят дефект позвоночника, как при spina bifida (миеломенингоцеле), а затем корригировала его в матке, как это делают хирурги при фетальной хирургии у человека. Некоторым ягнятам перед этим прямо на открытый спинной мозг наносили мезенхимальные стволовые клетки (МСК) пуповины человека. Клетки были взяты из Desacell, готового к применению продукта из ткани пуповины одного здорового новорожденного. В более ранних исследованиях на овцах клетки наносили на заплату, поэтому это первое сообщение о таком применении жидкой клеточной суспензии.

Исследование показало, что клетки удалось нанести всем пяти ягнятам, которым это планировалось. Помогли ли клетки, оно показать не смогло. Живыми родились только трое из семи прооперированных ягнят (двое леченых, один нелеченый), у всех троих баллы движений были нормальными или почти нормальными, а у нелеченого ягненка плотность выживших крупных нервных клеток оказалась даже наибольшей. Авторы сами говорят, что выборка была слишком маленькой для какого-либо сравнения групп.

Цель:

Основная цель состояла в том, чтобы проверить, можно ли во время фетальной коррекции spina bifida у овец нанести готовый к применению продукт МСК пуповины человека (Desacell) местно на спинной мозг. Дополнительно хотели выяснить, улучшают ли клетки движения по шкале Sheep Locomotor Rating (SLR), увеличивают ли они площадь спинного мозга и его серого вещества и связана ли плотность крупных нервных клеток с движениями.

Методы:

Использовали беременных овец от одного заводчика, все ягнята были от одного барана. Исследование одобрил орган власти земли Гамбург в соответствии с Законом Германии о защите животных.

Примерно на 75-й день беременности (беременность овцы длится около 145 дней) хирурги вскрывали матку, удаляли кожу, мышцы спины и костные дуги позвонков от L1 до L5 и вскрывали оболочку, покрывающую спинной мозг. В результате спинной мозг остается открытым для амниотической жидкости, как при spina bifida. Примерно через 25 дней ягнятам проводили вторую операцию для коррекции дефекта. Ягнят распределяли в соотношении два к одному на коррекцию с клетками или без них. В группе клеток рубцовую ткань над спинным мозгом очищали и прямо на спинной мозг наносили 1 мл гелевой суспензии Desacell с 30 миллионами клеток. Затем всем ягнятам накладывали многослойную заплату и закрывали кожу. При двойнях одного близнеца лечили, а другой служил контролем или не оперировался.

Клетки были получены из одной донорской пуповины, соответствовали международным критериям подлинности МСК и проверялись на стерильность, микоплазму и эндотоксин. Их размораживали, отмывали, подсчитывали и доставляли к месту операции охлажденными (4 °C).

Ягнята рождались в срок, и их снимали на видео через 2 и 48 часов после рождения. Оценщики, не знавшие, какие ягнята получили клетки, оценивали движения по 15-балльной шкале SLR, где 15 означает нормальную ходьбу, а 0-4 – тяжелое нарушение. Затем ягнят подвергали эвтаназии, а поясничный отдел спинного мозга разрезали на пять-восемь сегментов, окрашивали и измеряли. Нейропатолог, тоже не знавший групп, подсчитывал крупные двигательные нервные клетки на квадратный миллиметр серого вещества. До начала исследования авторы рассчитали, что группы из трех и шести ягнят дадут статистическую мощность всего 25,5%, то есть реальную разницу, скорее всего, не удалось бы обнаружить.

Результаты:

Выживаемость: Дефекты создали у 11 плодов ягнят в среднем на 76,9-й день.

• Трое были потеряны после первой операции. У одной овцы развилось расхождение раны с кишечной непроходимостью, и ее подвергли эвтаназии, один плод погиб после лихорадки у овцы, а один погиб в день осложнения раны.
• Еще у одного ягненка до плода не удалось добраться хирургически, поэтому коррекцию провели семи ягнятам, в среднем на 104,3-й день. Пятеро получили клетки, двое нет.
• Еще четыре плода погибли через 11-17 дней после коррекции: трое из пяти леченых и один из двух нелеченых. У одного был грибковый абсцесс у позвоночника с распространенной грибковой инфекцией. Причина остальных смертей была неясна.
• Живыми родились три ягненка на 144-147-й день: ягненок 1 (без клеток) и ягнята 3 и 4 (с клетками). В статье общая частота живорождения указана как 30%.

Движения (шкала SLR, из 15):

• Ягненок 1 (без клеток) получил 15 через 2 часа и 15 через 48 часов.
• Ягненок 3 (с клетками) получил 13 через 2 часа и 15 через 48 часов.
• Ягненок 4 (с клетками) получил 15 через 2 часа и 15 через 48 часов.

Таким образом, все три ягненка к 48 часам ходили нормально независимо от того, получали они клетки или нет, поэтому баллы не могли показать никакой пользы.

Ткань спинного мозга: Ни у одного ягненка опухоли не обнаружено ни невооруженным глазом, ни под микроскопом.

• Средняя плотность крупных нервных клеток составила 20,4 на мм² у нелеченого ягненка против 15 и 13,1 на мм² у двух леченых. Авторы отмечают, что это противоположно результатам более ранних исследований.
• Средняя площадь серого вещества была больше у леченых ягнят (274 и 218 единиц против 171 у нелеченого), а доля серого вещества в спинном мозге составила 0,32 и 0,48 против 0,31. Авторы предполагают, что это «возможно, может указывать на лучшую сохранность ткани».
• Площади измеряли в пикселях изображения, а статистические тесты для сравнения ягнят не приводились.

Выводы:

Авторы заключают, что нанесение продукта МСК пуповины человека во время фетальной коррекции spina bifida у овец осуществимо и что нужны более крупные исследования с Desacell для проверки влияния на движения, защиту нервов и безопасность.

Исследование – это первый технический шаг. Оценить удалось только одного нелеченого и двух леченых ягнят, поэтому результаты не могут показать, работают ли клетки. Авторы называют три основных ограничения: высокую смертность плодов, которая лишила всякой возможности значимого сравнения и может отражать хирургические проблемы, не связанные с клетками; отсутствие специального окрашивания (иммуногистохимии), поэтому они не смогли подтвердить, что клетки еще находились в области коррекции; и слишком мало выживших, чтобы баллы движений что-то значили. Кроме того, нелеченый ягненок ходил нормально, что указывает на то, что дефект в этой модели не вызвал у этих животных стойкой слабости, а при одном ягненке на сравнение различия в сером веществе и нервных клетках вполне могут быть случайными. Долгосрочные исходы, такие как функция мочевого пузыря или фиксация спинного мозга, не изучались, потому что ягнят обследовали только до 48 часов после рождения.

Дополнительная информация:

В Европе spina bifida встречается примерно в 1 из 2000 беременностей. Исследование MOMS показало, что коррекция дефекта до рождения вдвое снижает потребность в шунте для отвода жидкости из мозга и вдвое повышает вероятность ходьбы в 30 месяцев, но 58% детей, прооперированных до рождения, все равно не могут ходить самостоятельно. Исследователи надеются, что добавление стволовых клеток во время коррекции поможет лучше защитить открытый спинной мозг.

Клеточный продукт Desacell описан как готовый к применению продукт, изготовленный по запатентованному протоколу выделения. Статья не называет его производителя или владельца патента. Авторы указывают, что его проверяли на грызунах и недоношенных бабуинах, у взрослых с тяжелой дыхательной недостаточностью (CIRCA-19), у недоношенных детей с риском хронического заболевания легких (HULC-1), а также изучают у взрослых с септическим шоком (UC-CISS II). Цитируемое ими исследование на бабуинах под руководством соавтора Мёбиуса (Möbius) называется «Prophylactic administration of mesenchymal stromal cells does not prevent arrested lung development in extremely premature-born non-human primates» («Профилактическое введение мезенхимальных стромальных клеток не предотвращает остановку развития легких у глубоко недоношенных приматов»). Двое авторов работают в Саксонском центре здоровья плода и новорожденного Технического университета Дрездена.

Исследование финансировал Немецкий научно-исследовательский фонд (DFG BA 7308/4-1). Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Работа является только экспериментом на животных, и авторы указывают на продолжающееся исследование CuRe, в котором используются клетки плаценты на заплате, как на первое исследование у людей со стволовыми клетками, вводимыми во время фетальной коррекции spina bifida.