Безопасность и эффективность мезенхимальных стромальных клеток пуповины человека при фетальной коррекции миеломенингоцеле у овец. Краткое изложение

Основные положения и результаты:

Это доклиническое исследование проведено на плодах овец. Детей не лечили. Французская команда из Парижа готовит программу фетальной хирургии, в которой к пренатальной коррекции миеломенингоцеле добавляются мезенхимальные стромальные клетки пуповины (UC-MSC). Статья сообщает о первой проверке UC-MSC человека, типа клеток, широко используемого в клинической клеточной терапии, помещенных на спинной мозг плодов ягнят.

У ягнят, получивших клетки, спинной мозг при гистологическом исследовании был лучше сохранен, и разница была статистически значимой. Они также, как правило, лучше двигались, хотя результаты по движениям статистической значимости не достигли. Живыми родились только девять ягнят, и их изучали 24 часа. Почти половина всех прооперированных плодов была потеряна. Авторы указывают, что перенос на людей должен подождать более долгосрочных данных на животных.

Цель:

Оценить безопасность и эффективность фибриновой заплаты с UC-MSC человека, применяемой в дополнение к фетальной хирургической коррекции миеломенингоцеле на модели овцы.

Методы:

UC-MSC выделяли методом эксплантов из трех пуповин человека, которые женщины с согласия пожертвовали после естественных родов. Клетки соответствовали определению Международного общества клеточной терапии. Они прикреплялись к пластику, имели веретенообразную форму, были положительны по CD73, CD90 и CD105 и отрицательны по CD45, CD11b, CD14, CD34 и CD79a.

Заплату делали накануне операции из коммерческого набора фибринового герметика (Evicel). Для клеточной заплаты 17 миллионов UC-MSC 5-го пассажа смешивали с раствором фибриногена, прежде чем отвердить его тромбином в чашке. Контрольные заплаты были такими же, но без клеток. При покадровой микроскопии клетки свободно перемещались по заплате и за 72 часа принимали свою обычную веретенообразную форму.

У плодов ягнят на 75-й день беременности хирургически создавали дефект позвоночника (ламинэктомия L1-L5 с удалением твердой мозговой оболочки). Через 14 дней, на 89-й день, его корригировали: заплату укладывали на спинной мозг, а кожу плода закрывали над ней. Овец ежедневно проверяли на общее состояние, температуру и заживление раны. Ягнят извлекали путем кесарева сечения на 142-й день.

Ветеринар, не знавший типа заплаты, оценивал движения через 2 и 24 часа жизни по шкале Sheep Locomotor Rating (0 означает полную параплегию, 15 – норму). Затем ягнят подвергали эвтаназии. Все крупные органы исследовали на опухоли невооруженным глазом и под микроскопом. На уровне L3-L4 зоны коррекции команда измеряла площадь спинного мозга, площадь серого вещества, число крупных нейронов (мотонейронов) на квадратный миллиметр серого вещества и толщину рубцовой ткани. Группы сравнивали U-критерием Манна-Уитни.

Результаты:

Дефект создали у 17 плодов. Двое погибли внутриутробно до коррекции, поэтому коррекцию провели 15, 8 с клеточной заплатой и 7 с контрольной. После коррекции были потеряны 2 из 8 в группе клеток и 4 из 7 в контрольной группе. Общая потеря плодов составила 47% (8 из 17). Всего живыми родились 9 ягнят, 6 с клетками и 3 контрольных.

Безопасность: Ни у одной овцы не было лихорадки или других осложнений, и признаков отторжения клеток человека не было. Зона коррекции полностью зажила у всех девяти ягнят, без подтекания спинномозговой жидкости и без инфекции. Ни у одного ягненка не обнаружено опухоли ни при клиническом осмотре, ни в каком-либо органе через 54 дня после нанесения клеток. Ни у одного ягненка не было грыжи заднего мозга.

Движения:

• Балл локомоции через 2 часа: медиана 4,0 (диапазон 0-13) с клетками против 2,0 (0-5) без них, p = 0,32.
• Балл локомоции через 24 часа: медиана 15,0 (диапазон 2-15) с клетками против 2,0 (2-5) без них, p = 0,07.
• Способность стоять без поддержки: 3 из 5 с клетками, 0 из 3 без них, p = 0,08.
• Атрофия мышц: 1 из 6 с клетками, 2 из 3 без них, p = 0,13.

Ни одно из этих различий не достигает общепринятого порога p ниже 0,05. По крайней мере один леченый ягненок набрал всего 2 балла, что не лучше контрольных.

Спинной мозг под микроскопом:

• Плотность крупных нейронов: 9,9 на мм² серого вещества с клетками против 6,3 без них (p = 0,04).
• Площадь серого вещества: 6,2 против 1,9 мм² (p = 0,01).
• Площадь спинного мозга: 16,1 против 7,5 мм² (p = 0,02).
• Толщина рубца вокруг спинного мозга: 70,9 против 253,7 микрометра (p = 0,10). Толщина рубца в зоне коррекции: 691,3 против 1684,4 микрометра (p = 0,18). Обе были меньше с клетками, но без достижения значимости.

Аннотация описывает баллы локомоции как средние. Таблица результатов в основном тексте статьи обозначает их как медианы с диапазонами, что соответствует и использованному статистическому тесту. Это изложение следует таблице.

Выводы:

Авторы заключают, что UC-MSC человека, применяемые вместе с фетальной операцией при миеломенингоцеле, были безопасны у овец, что клетки, по-видимому, действуют через выделяемые вещества, а не превращаясь в нервную ткань или распространяясь по организму, и что применение у людей «будет рассмотрено после подтверждения этих результатов безопасности в течение более длительного периода на модели животного».

Ограничения, которые называют авторы:

• Малое число животных в каждой группе с вероятной недостаточной статистической мощностью.
• Высокая частота потери плодов, хотя она сходна с другими работами по фетальной хирургии на крупных животных. В обзоре 232 ягнят ведущей американской группы выживаемость составила только 43%.
• По финансовым причинам ягнят нельзя было сохранять живыми дольше 24 часов, поэтому о среднесрочной или долгосрочной безопасности и функции ничего не известно. Идет последующее исследование с наблюдением в 1 и 6 месяцев жизни.
• Польза была меньше, чем в более ранних экспериментах команды с UC-MSC овец. Авторы подозревают различия между донорами, поскольку три использованные пуповины могли плохо вырабатывать защитные факторы. Они проверяют два решения: объединение клеток нескольких доноров и тест активности для отбора доноров с высокой секрецией.

Дополнительная информация:

Авторы отмечают, что даже после фетальной хирургии 71% детей не могут ходить самостоятельно в восемь лет, а 75% нуждаются в ежедневной катетеризации мочевого пузыря в десять лет. Поэтому несколько групп добавляют к операции клетки. Калифорнийская группа, использующая клетки из плаценты, начала исследование у людей. Французская группа говорит, что только она использует клетки пуповины.

В лабораторной работе команды UC-MSC человека выделяют нейротрофический фактор мозга и фактор роста гепатоцитов, которые защищают нервные клетки, а также противорубцовые факторы. В более раннем исследовании по отслеживанию флуоресцентных клеток пересаженные клетки не перемещались в отдаленные органы.

Для оценки безопасности у людей авторы ссылаются на два крупных метаанализа рандомизированных исследований UC-MSC при других заболеваниях, в основном с внутривенным введением взрослым и детям, в которых единственным нежелательным явлением, связанным с клетками, была преходящая лихорадка, а об опухолях не сообщалось. Ни одни из этих данных не относятся к применению у плода, и авторы признают, что для UC-MSC это никогда не изучалось.