Аллогенные мезенхимальные стромальные клетки пуповины улучшают двигательную функцию при пренатальной хирургической коррекции миеломенингоцеле: исследование на модели овцы. Краткое изложение

Основные положения и результаты:

Это доклиническое исследование проведено на плодах овец. Детей не лечили. Французская команда из Парижа, которая готовится добавить мезенхимальные стромальные клетки пуповины (UC-MSC) к пренатальной хирургической коррекции миеломенингоцеле, во время коррекции накладывала на открытый спинной мозг плодов ягнят фибриновую заплату с UC-MSC донорских овец. Ягнят, которым коррекцию провели с клеточной заплатой, сравнивали с ягнятами, получившими такую же заплату без клеток.

Через день после рождения ягнята, получившие клетки, двигались лучше, ни у одного из них не было подтекания мочи, а под микроскопом в их спинном мозге было больше крупных нервных клеток и гораздо меньше рубцовой ткани. Эти различия были статистически значимыми. Другие показатели, включая исследования нервной проводимости, размер мышц и толщину сфинктеров, различий не показали. Живыми родились только девять ягнят, и наблюдали их 24 часа, поэтому о более долгосрочных эффектах и безопасности исследование ничего не говорит.

Цель:

Изучить влияние аллогенной (донорской) заплаты с UC-MSC, наложенной во время фетальной операции, на двигательную функцию и функцию сфинктеров в первые 24 часа жизни на модели миеломенингоцеле у овцы.

Методы:

Исследование одобрил Национальный комитет Франции по исследованиям на животных, и оно проводилось по рекомендациям ARRIVE для исследований на животных.

UC-MSC выращивали методом эксплантов из пуповин трех ягнят, родившихся путем кесарева сечения незадолго до срока. Клетки были веретенообразными, прикреплялись к пластику и несли маркеры МСК овцы CD29, CD90, CD73, CD44 и CD166, но не CD31 и не CD45. Для каждой клеточной заплаты 17 миллионов клеток 5-го пассажа смешивали с фибриногеном из коммерческого набора фибринового герметика (Evicel) и отверждали тромбином. Контрольные заплаты делали так же, но без клеток. Оба вида были гибкими и толщиной около 2 мм.

У плодов ягнят на 75-й день беременности хирургически создавали дефект позвоночника (ламинэктомия L1-L5 с удалением твердой мозговой оболочки) и корригировали его на 89-й день. Заплату укладывали на спинной мозг, а кожу плода закрывали над ней. Хирурги знали, какая заплата использована. Ягнят извлекали путем кесарева сечения на 140-142-й день и сохраняли живыми 24 часа.

Через 2 и 24 часа жизни детский врач-реабилитолог и ветеринарный хирург, не знавшие группы, оценивали движения по шкале Sheep Locomotor Rating (SLR, от 0 при полном параличе до 15 в норме), а также стояние, рефлексы, чувствительность и мышечную атрофию (амиотрофию). Ягненка считали удерживающим мочу, если он принимал нормальную позу для мочеиспускания и у него не было подтекания при надавливании на мочевой пузырь. Через 24 часа под наркозом ветеринарный невролог, не знавший группы, регистрировал электрическую активность мышц, нервную проводимость и спинальные вызванные потенциалы, а сканирование позвоночника измеряло размер дефекта. Затем ягнят подвергали эвтаназии. Нейропатолог, не знавший группы, измерял площадь спинного мозга, площадь серого вещества, плотность крупных нейронов и толщину рубцовой ткани (фиброза), а все крупные органы исследовали на опухоли.

Исследование планировалось на четырех ягнят в группе, исходя из предположения, что балл SLR выше 12 будет у 90% леченых и 10% контрольных ягнят. Группы сравнивали U-критерием Манна-Уитни и критерием хи-квадрат.

Результаты:

Заплаты наложили 13 плодам. Четыре были потеряны: два выкидыша (по одному в каждой группе) и две внутриутробные гибели, одна обнаружена во время коррекции, а один леченый плод погиб при кесаревом сечении. Общая потеря плодов составила 31%. Живыми родились девять ягнят, 5 с клеточной заплатой и 4 с контрольной.

Безопасность: Все девять корригированных дефектов полностью зажили. Ни у одного ягненка не было грыжи заднего мозга, и ни в одном органе опухоли не обнаружено. Причины четырех потерь плодов установить не удалось, так как вскрытие было невозможно.

Движения:

• SLR через 2 часа: медиана 2 (диапазон 1-7) с клетками против 2 (1-6) без них, p = 0,83.
• SLR через 24 часа: медиана 14 (диапазон 13-15) с клетками против 5 (4-14) без них, p = 0,04.
• Способность стоять без поддержки: 5 из 5 с клетками, 2 из 4 без них, p = 0,07 (не значимо).
• Атрофия мышц задних конечностей: 0 из 5 с клетками, 3 из 4 без них, p = 0,02.

Удержание мочи: Недержания не было ни у одного из 5 леченых ягнят и было у всех 4 контрольных (p = 0,002). Авторы отмечают, что это была простая клиническая оценка, не подтвержденная исследованием мочевого пузыря или гистологией.

Нервные тесты и сканирование позвоночника: Спонтанная электрическая активность мышц, амплитуды и скорости нервной проводимости и спинальные вызванные потенциалы значимо между группами не различались. Сканирование позвоночника показало дефекты сходного размера и сходное искривление позвоночника в обеих группах.

Спинной мозг под микроскопом:

• Плотность крупных нейронов: 14,5 на мм² серого вещества с клетками против 5,6 без них (p = 0,001).
• Рубцовая ткань между спинным мозгом и кожей: толщина 453 против 3921 микрометра (p = 0,03).
• Рубцовая ткань вокруг спинного мозга: толщина 47 против 158 микрометров (p = 0,0001).
• Площадь серого вещества (8,2 против 7,1 мм², p = 0,74) и площадь спинного мозга (21,8 против 16,7 мм², p = 0,44) значимо не различались.

Мышцы и сфинктеры: Масса и размер волокон двух мышц задних конечностей, а также толщина мочевого и анального сфинктеров были сходными в обеих группах.

В статье есть несоответствия в изложении. В тексте некоторые результаты названы «средними», тогда как в таблицах и методах приведены медианы. Несколько диапазонов в таблице внепозвоночных данных не могут быть верными (например, контрольная медиана 13,7 с диапазоном 45,3-49,4), а таблица сканирования позвоночника повторяет числа строк о массе мышц. На основные результаты выше это не влияет.

Выводы:

Авторы заключают, что заплаты с UC-MSC, применяемые вместе с пренатальной коррекцией миеломенингоцеле у овец, «улучшают двигательную функцию и функцию сфинктеров», наряду с лучшей сохранностью спинного мозга и меньшим фиброзом, и что нужны дальнейшие исследования долгосрочной безопасности и возможности переноса подхода на людей.

Ограничения, которые называют авторы:

• Маленькая выборка, отчасти из-за потерь плодов, которые часты в этой модели на животных.
• Наблюдение всего 24 часа, потому что уход за ягнятами с возможной инвалидностью дорог и сложен, что ограничивает выводы об эффективности, переносимости и безопасности.
• Субъективная оценка удержания мочи, не подтвержденная гистологически.
• Исследования нервной проводимости и вызванных потенциалов не показали различий, возможно, потому что исследование было слишком маленьким или потому что нервные цепи у овец и людей различаются.

Осторожности требуют и другие моменты. Хирурги знали, к какой группе относится плод. Способность стоять значимо не различалась. Результат по движениям через 24 часа основан на 5 животных против 4, а один контрольный ягненок набрал 14 баллов, столько же, сколько медиана у леченых.

Чем это исследование отличается от исследования той же команды с клетками человека: Позже та же группа повторила эксперимент с UC-MSC из пуповин человека (краткое изложение исследования). В этом более раннем исследовании клетки были от овец, движения и удержание мочи значимо различались через 24 часа, а рубцовая ткань значимо уменьшилась, тогда как площадь спинного мозга и серого вещества не различалась. В исследовании с клетками человека картина была почти обратной. Площадь спинного мозга, площадь серого вещества и плотность нейронов были значимо лучше, а результаты по движениям и уменьшение рубцовой ткани значимости не достигли. Авторы более позднего исследования предположили, что три донорские пуповины человека могли хуже вырабатывать защитные факторы. Оба исследования были маленькими, и ягнят наблюдали только 24 часа.

Дополнительная информация:

Авторы отмечают, что даже после фетальной хирургии 71% детей с миеломенингоцеле не могут самостоятельно ходить в восемь лет, а 75% к десяти годам нуждаются в ежедневной катетеризации мочевого пузыря. Более ранний эксперимент команды на овцах обнаружил лишь небольшое незначимое влияние UC-MSC на движения через 2 часа жизни, что, по мнению авторов, было слишком рано после рождения для оценки.

Калифорнийская группа, использовавшая МСК плаценты ранних сроков беременности на свином матриксе в той же модели, сообщила о медиане SLR 15 с клетками против 6 без них и о большей сохранности нейронов. Эта группа не нашла различий в функции мочевого пузыря, поэтому результат по удержанию мочи здесь новый и неподтвержденный.

Авторы считают, что UC-MSC действуют в основном за счет выделения факторов роста и защитных факторов, а не превращаясь в нервные клетки, но указывают, что точные механизмы пока неизвестны. Они предполагают, что уменьшение рубцовой ткани может быть важно для синдрома фиксированного спинного мозга, частой проблемы после коррекции миеломенингоцеле. В более раннем исследовании группы по отслеживанию клеток пересаженные клетки не были обнаружены в отдаленных органах.

Исследование финансировали два французских благотворительных фонда медицинских исследований, Fondation de l’Avenir и Fondation pour la Recherche Médicale. Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов. Журнал опубликовал сопроводительный комментарий Анны Л. Дэвид (Anna L. David).